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RIPA裂解液(中強(qiáng)度)
產(chǎn)品貨號(hào):RR0801
產(chǎn)品品牌:AboRo
產(chǎn)品分類:分子生物學(xué)試劑
產(chǎn)品規(guī)格:100ml
產(chǎn)品價(jià)格:199

產(chǎn)品介紹

RIPA 即Radio Immunoprecipitation Assay,是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液。AboRo的RIPA 裂解液裂解所得的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western 等實(shí)驗(yàn)。主要成分是:50mMTris(pH 7.6),150mM NaCl,1% TritonX-100,0.5% sodiumdeoxycholate,0.1% SDS 等多種裂解劑和抑制劑,能有效地抑制蛋白降解。

使用方法

1. 取適當(dāng)量的NCM RIPA Buffer 裂解液,在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF,使PMSF 的最終濃度為1mM。

注意:NCM RIPA Buffer 不含蛋白酶等抑制劑,根據(jù)需要在使用前添加蛋白酶,磷酸酶等抑制劑。

2. 樣品前處理

(a)對(duì)于貼壁細(xì)胞:去除培養(yǎng)液,用PBS、生理鹽水或無(wú)血清培養(yǎng)液洗一遍(如果血清中的蛋白沒(méi)有干擾,可以不洗)。按照6 孔板每孔加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下,使裂解液和細(xì)胞充分接觸。通常裂解液接觸細(xì)胞1-2 秒后,細(xì)胞就會(huì)被裂解,然后轉(zhuǎn)移至離心管中。

(b)對(duì)于懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6 孔板每孔細(xì)胞加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒(méi)有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多,必需分裝成50-100 萬(wàn)細(xì)胞/管,然后再裂解。

(c)對(duì)于組織樣品:把組織剪切成細(xì)小的碎片,按照每20mg 組織加入150-250ul 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當(dāng)減少裂解液的用量) ,用玻璃勻漿器勻漿,直至充分裂解。

3. 上述樣品轉(zhuǎn)移至冰上,裂解30 分鐘,中間15 分鐘后補(bǔ)加一次終濃度1mM PMSF。充分裂解后,10000-14000g離心3-5 分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western 和免疫沉淀等操作。


注意事項(xiàng)

1.RIPA 裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物,屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA 等的復(fù)合物。在不檢測(cè)和基因組DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);如果需要檢測(cè)和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測(cè)一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,例如NFκB、p53 等時(shí),通常不必進(jìn)行超聲處理,就可以檢測(cè)到這些轉(zhuǎn)錄因子。

2.為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)效果,可適當(dāng)分裝使用,以盡量避免反復(fù)凍融。

3.PMSF 應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)加,需自備PMSF,或者可以蛋白酶抑制劑混合物。

4.裂解蛋白的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。

5.蛋白酶抑制劑均有較高的毒性,為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。4℃保存,室溫運(yùn)輸,一年有效。

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